作為科研生產(chǎn)中較重要的基礎(chǔ)性資源—菌毒種,其收集、保藏及相關(guān)的研究工作在我國正處于整理、整合以及全方面逐步正規(guī)化階段.2003年7月23日,科技部在北京召開了“國家科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)建設(shè)”部際聯(lián)席會(huì)和專家顧問組成立大會(huì),正式啟動(dòng)了國家科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)建設(shè)工作.國家自然科技資源共享平臺(tái)建設(shè)作為其中的一個(gè)重要組成部分同步啟動(dòng).作為該項(xiàng)8的一個(gè)重要組成部分,微生物菌種資源整理、整合工作同期啟動(dòng),在此項(xiàng)工作中,中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所承擔(dān)了獸醫(yī)微生物資源整理、整合工作.本所在行業(yè)內(nèi)發(fā)展了數(shù)家加盟單位,在整理、整合菌種資源的過程中遇到了一些實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌鑒定結(jié)果出現(xiàn)偏差的問題.經(jīng)分析調(diào)查,多是由于實(shí)驗(yàn)室人員結(jié)構(gòu)以及實(shí)驗(yàn)室的硬件水平差別較大等原因,造成實(shí)驗(yàn)室間鑒定能力的參差不齊,致使鑒定項(xiàng)目完成情況不盡相同,細(xì)菌鑒定結(jié)果出現(xiàn)偏差。
細(xì)菌鑒定是指將分離培養(yǎng)獲得的病原菌,通過純化培養(yǎng)使其達(dá)到不含有其他微生物的純培養(yǎng)程度,繼而進(jìn)行系統(tǒng)鑒定.而菌種保藏機(jī)構(gòu)在收集一些已經(jīng)凍干的菌種時(shí),應(yīng)在開啟后經(jīng)過兩代的適應(yīng)性培養(yǎng)方可進(jìn)行復(fù)核性的系統(tǒng)鑒定.系統(tǒng)鑒定是通過細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長特性、抗原性、病原性以及目前流行的核酸測(cè)定方法等檢測(cè),并用已知標(biāo)準(zhǔn)免疫血清確定分離細(xì)菌的屬、種和型(群).目前菌種保藏機(jī)構(gòu)通常使用的細(xì)菌鑒定方法大致有以下幾種：
傳統(tǒng)方法
常規(guī)宏觀菌落形態(tài)學(xué)觀察,主要觀察菌落在其適合的培養(yǎng)基上的生長狀況:細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上的生長形態(tài)、大小、顏色是否均勻一致,菌落個(gè)體表面及邊緣的生長狀況;在液體培養(yǎng)基上的渾濁狀況、沉淀狀況、液面菌膜狀況;半固體上穿刺接種后,觀察細(xì)菌是否沿著接種線生長以及其生長狀態(tài)是呈毛刷樣生長還是均勻生長,上下生長是否一致.在鑒別培養(yǎng)基上培養(yǎng),觀察結(jié)果是否跟預(yù)期結(jié)果相同。
細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)學(xué)觀察,即通過顯微鏡觀察.觀察前細(xì)菌需要著色,要根據(jù)預(yù)先確定的觀察項(xiàng)目選擇與之相對(duì)應(yīng)的染色方法,目前常用的染色方法包括革蘭氏染色法、美藍(lán)染色法、Ziehl—Neelsen染色法、姬姆薩染色法、鞭毛染色法、芽胞染色法等.盡量挑選對(duì)數(shù)生長期的細(xì)菌進(jìn)行染色觀察,此時(shí)的細(xì)菌生長處于幼期,利于觀察,因?yàn)橐恍╆惻f細(xì)菌的染色結(jié)果會(huì)有變化,如本為革蘭氏陽性菌經(jīng)過長期擱置后染色結(jié)果可能為革蘭氏陰性.同時(shí)細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)要注意培養(yǎng)基的挑選,一些細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)如莢膜、鞭毛、菌毛、芽胞等,其表達(dá)是需要在特定的培養(yǎng)基上才能正常發(fā)育,有的細(xì)菌如炭疽在一般的培養(yǎng)基上不形成莢膜,只在動(dòng)物體內(nèi)形成明顯的莢膜,所以需先接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后用病料進(jìn)行涂片鏡檢.在鏡檢時(shí)觀察細(xì)菌基本形態(tài)結(jié)構(gòu)和大小及其排列狀態(tài)、菌端形狀、有無兩極染色、有無形成芽胞和莢胞等。
形態(tài)學(xué)鑒定輔以生化試驗(yàn)在細(xì)菌鑒定中具有重要的意義,生化試驗(yàn)是根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)過程中不同菌種所產(chǎn)生的新陳代謝產(chǎn)物各異,表現(xiàn)出不同的生長特性.通過生物化學(xué)的方法來檢測(cè)這些物質(zhì)的存在與否,從而能夠得到細(xì)菌的鑒定結(jié)果.如糖(醇)類代謝試驗(yàn)、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn)、有機(jī)酸鹽和胺鹽利用試驗(yàn)、呼吸酶類試驗(yàn)、毒性酶類試驗(yàn)等
血清型鑒定是根據(jù)細(xì)菌具有相對(duì)特異性的抗原結(jié)構(gòu)這個(gè)特點(diǎn)進(jìn)行微生物鑒定的特異方法.抗原的特異性程度又存在于屬間細(xì)菌所共有的共同抗原,這種抗原的存在,能表明其屬性.另一類特異性抗原只存在于特定的種、型,是確定細(xì)菌種、型的重要依據(jù).通過專門的分型血清即可對(duì)這些細(xì)菌的血清型進(jìn)行鑒定。
細(xì)菌毒力的測(cè)定,病原菌侵入機(jī)體能否引起疾病與其本身的毒力、侵入機(jī)體的數(shù)量和侵入部位有關(guān).不同的病原菌或同種細(xì)菌不同的型或株,毒力常不一致.常用LD50或ID50表示毒力,即在一定時(shí)間內(nèi),能使一定條件的某種動(dòng)物半數(shù)死亡或感染需要的較小細(xì)菌數(shù)或毒素量.毒力測(cè)定在菌種鑒定過程中可用于鑒別一些有代表性的菌株.LD50可用Reed—Muench公式進(jìn)行計(jì)算。
儀器自動(dòng)化鑒定
隨著儀器分析技術(shù)的進(jìn)步和計(jì)算機(jī)的廣泛應(yīng)用,微生物菌種鑒定逐漸由傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察和人工生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定發(fā)展進(jìn)入了基于儀器自動(dòng)化分析的鑒定系統(tǒng)階段.近20年來,一系列商品化自動(dòng)鑒定系統(tǒng)相繼推出,并在應(yīng)用中取得理想效果,如VITEK系統(tǒng)、MIDl系統(tǒng)、BIOLOG系統(tǒng)、 SENSITl．TRE系統(tǒng)、AUTOSCEPTOR系統(tǒng)以及MICROSCAN系統(tǒng)等.下面以BIOLOG微生物鑒定系統(tǒng)為例,簡(jiǎn)述微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)的工作原理:BIOLOG微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)是美國Biolog公司從1989年開始推出的一套微生物鑒定系統(tǒng),該系統(tǒng)主要根據(jù)細(xì)菌對(duì)糖、醇、酸、醋、胺和大分子聚合物等95種碳源的利用情況進(jìn)行鑒定.細(xì)菌利用碳源進(jìn)行呼吸時(shí),會(huì)將四哇類氧化還原染色劑(TV)從無色還原成紫色,從而在鑒定微平板(96孔板)上形成該菌株特征性的反應(yīng)模式或“指紋圖譜”,通過纖維光學(xué)讀取設(shè)備——讀數(shù)儀來讀取顏色變化(分為“自動(dòng)”和“人工”兩種讀取方式),由計(jì)算機(jī)通過概率較大模擬法將該反應(yīng)模式或“指紋圖譜”與數(shù)據(jù)庫相比較,可以在瞬間得到鑒定結(jié)果,確定所分析的菌株的屬名或種名.以BIOLOG系統(tǒng)6．01版數(shù)據(jù)庫為例,包含了革蘭氏陰性好氧菌524種、革蘭氏陽性好氣菌341種、厭氧菌361種、酵母菌267種、絲狀真菌(含部分酵母菌)619種以及幾種特殊的致病菌,目前這個(gè)數(shù)據(jù)庫已進(jìn)行更新.利用微生物快速系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定,能節(jié)省時(shí)間,但由于其在數(shù)據(jù)比對(duì)過程中記入一些非特異性的陽性反應(yīng)孔,會(huì)造成偶然誤差,從而引起個(gè)別鑒定結(jié)果不穩(wěn)定,另外此類儀器本身及其耗材價(jià)格均較高。
分子生物學(xué)鑒定
分子生物學(xué)鑒定目前比較流行的主要是核酸檢測(cè)技術(shù),包括基因測(cè)序、指紋圖譜技術(shù)、基因探針技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、GC含量測(cè)定等.PCR和核酸雜交單獨(dú)或結(jié)合在儀器已經(jīng)形成比較經(jīng)典的核酸檢測(cè)技術(shù),目前這兩者已經(jīng)得到了較大范圍的推廣和應(yīng)用。
下面將簡(jiǎn)單介紹幾種核酸檢測(cè)技術(shù)的原理：
DNA的G+C含量測(cè)定法
此法是根據(jù)細(xì)菌的DNA中G+C含量的特異性來進(jìn)行細(xì)菌鑒定,通過熔解溫度(Tm)法或浮力密度法測(cè)定細(xì)菌DNA中G+C的含量,通過對(duì)比來鑒定細(xì)菌。
擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)分析
此法是一種測(cè)定基因組限制性片段的DNA指紋技術(shù),通過PCR選擇性地?cái)U(kuò)增整個(gè)基因組DNA的內(nèi)切酶片段,在分辨率高的聚丙烯酰氨凝膠上電泳,產(chǎn)生一組特異的DNA限制性片段的指紋圖譜.與其他DNA指紋技術(shù)相比有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn):可用于各種大小不同的基因組的指紋分析,為研究細(xì)菌屬乃至株間的親緣關(guān)系提供一個(gè)有效手段;具有一定的靈活性,可通過特異性PCR引物的設(shè)計(jì)和內(nèi)切酶組合的選擇,調(diào)整AFLP圖譜中限制性片段的適宜數(shù)目;由于適用了嚴(yán)格的PCR條件和高分辨率的聚丙烯酰氨凝膠電泳,因而重復(fù)性好,分辨率高;AFLP不僅僅是簡(jiǎn)單的指紋技術(shù),而且可作為連接遺傳圖譜與物理圖譜間的橋梁而用于基因組的研究。
限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析
其原理是用限制性內(nèi)切酶將細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行切割,之后在瓊脂糖凝膠上電泳分離,以顯示不同種群基因組DNA的限制性片段長度多態(tài)性.RFLP產(chǎn)生的指紋圖譜更適用于細(xì)菌種間及種內(nèi)株間的分型鑒定。
隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性(RAPD)分析,又稱為隨意引物PCR(AP—
它是一種DNA指紋多態(tài)性分析技術(shù),其理論依據(jù)是不同的基因組中與隨意引物匹配的堿基序列的位點(diǎn)和數(shù)目可能不同,因而用一組人為設(shè)計(jì)的核苷酸作為引物,通過PCR隨機(jī)擴(kuò)增可產(chǎn)生物種特異性的DNA帶譜。
16S rRNA鑒定
細(xì)菌的核糖體RNA(rRNA)基因高度保守且進(jìn)化速度緩慢,在漫長的進(jìn)化過程中保留了rRNA基因結(jié)構(gòu)和功能的同源性,在微生物染色體上可存在多個(gè)拷貝,以rRNA基因片段為探針可檢出含有rRNA基因的DNA片段.分析雜交后得到的rRNA指紋圖,為菌種定型和近緣菌株的鑒定提供了一種新技術(shù).針對(duì)rRNA基因的核糖體分型可成功地區(qū)分多個(gè)菌種的相關(guān)菌株,因此該技術(shù)也被廣泛稱作核糖體分型技術(shù).原核生物含有23S、16S和5S三種 rRNA,其大小分別約為3000、1500和120個(gè)堿基.其中作為小亞單位核糖體RNA的16S rRNA的大小較適合于核糖體分型.一般完成l6S rRNA序列測(cè)定后,在GenBank中與已知的序列進(jìn)行BLAST分析,從而得出鑒定結(jié)果。
小結(jié)
一般來說,對(duì)于微生物的檢測(cè)或鑒定應(yīng)當(dāng)至少使用三種指標(biāo)同時(shí)進(jìn)行驗(yàn)證.傳統(tǒng)的分類鑒定需要測(cè)定的項(xiàng)目眾多,工作程序繁瑣,耗時(shí)長.在某些時(shí)候可以配合分子生物學(xué)的方法進(jìn)行鑒定,如在進(jìn)行菌株的血清型鑒定時(shí),對(duì)于某些國內(nèi)資源稀缺的菌株定型血清,而進(jìn)口定型血清價(jià)格昂貴,國內(nèi)可以開發(fā)分子生物學(xué)分型方法完成菌株的血清分型工作.而在利用分子生物學(xué)方法鑒定菌株血清型時(shí),經(jīng)常會(huì)遇到有一些菌株的血清型種類繁多,目前還無法通過簡(jiǎn)單的核酸測(cè)定完成血清定型工作,如大腸桿菌,僅O抗原就有上百種血清型,對(duì)于這種情況在使用血清進(jìn)行定型的同時(shí),還需要繼續(xù)深入研究其分型技術(shù).目前市場(chǎng)上的微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)雖然基本上都通過了相關(guān)權(quán)威組織的認(rèn)可,在細(xì)菌快速鑒定或初步鑒定中起到了一定的作用,但如前所述,其穩(wěn)定性尚存在一定問題,同樣需要配合其他方法來相互印證,從而完成細(xì)菌鑒定工作。
